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使用 Incucyte? 和 iQue? 定量分析動態 T 細胞功能

T 細胞在獲得性免疫中起到至關重要的作用,其獨特的表面受體,使其可以感知和響應不同類型的病原微生物,防御有害的靶細胞,如突發性腫瘤細胞。T 細胞的活化和增殖是免疫應答作用和程度調節的基礎,需要動態模型來理解 T 細胞對抗感染或疾病的生物學特性。

Incucyte? 活細胞分析系統和 iQue? 高通量流式細胞儀可用于評估和定量 T 細胞的關鍵功能,包括活化和聚集、抗體內化實驗、趨化性、細胞因子的產生,以及復雜共培養模型的評估,如免疫細胞殺傷和跨內皮細胞遷移實驗。

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T 細胞應用

使用相差成像和活細胞 ICC(抗-CD71 fabflur-488)對 PBMC 活化進行可視化處理。用抗-CD3 和 IL-2,或對照處理 PBMC(30, 000個/孔),并用抗 CD-71-Fabfluor-488 標記。a) 無標記相差成像檢測未活化和活化的 PBMC 之間的形態學差異;相差成像結合活細胞 ICC 的結果顯示,在活化的細胞中 CD71+ 有所上調。b) 在大細胞亞群和小細胞亞群中,活化可誘導細胞大小增加、細胞偏心率增加和 CD71+ 上調。

采用 iQue??高通量流式細胞儀和 ForeCyt??軟件進行 T 細胞活化評估。在不同的處理條件下,T 細胞激活百分比和分泌 IFNγ 水平的劑量和時間響應。每種供試化合物均觀察到獨特的 T 細胞活化標志物模式。

利用 Incucyte? 免疫細胞殺傷實驗可視化免疫細胞/腫瘤細胞的相互作用。(1) 細胞毒性 T 細胞(較?。┖蜆擞浀哪[瘤細胞(較大,紅色)之間的物理接觸。T 淋巴細胞分裂。(2) 腫瘤細胞被細胞毒性 T 淋巴細胞攻擊:“死亡之吻”。(3) 腫瘤細胞形成胞質顆粒,半胱天冬酶 3/7 標記(綠色),核固縮,細胞死亡。(4) 腫瘤細胞有絲分裂:一個細胞分裂為兩個。

使用 Incucyte? 免疫細胞殺傷試驗實時檢測腫瘤細胞的死亡和增殖(可選)。Incucyte? 軟件易于操作,可直接根據圖像檢測凋亡的腫瘤細胞(綠色無題,黃色輪廓),實時對活腫瘤細胞計數(Incucyte? NucLight 紅色染料標記的細胞核,藍色輪廓)。動力學讀數顯示治療效果呈時間依賴性。

靶細胞和細胞因子時間進程分析。用 PMBCS 去除 SKOV-3 NucLight 綠色細胞,使用 CD3/CD28 磁珠 (Dynabead) 進行活化。(A) 采用 Incucyte? 分析的靶細胞計數的時間進程。使用 TCA 試劑盒的 Qbead 組分(Qbeads 或 Assay Builder:IFNγ,選項 1 和 TNFα,選項 2)對僅使用 10 μL/天上清液樣品的 (B) IFNγ 和 (C) TNFα 的細胞因子時間進程數據進行定量分析/(D) 根據靶細胞計數 (Incucyte?) 和細胞因子 (iQue??3) 的經時變化繪制的 AUC 濃度響應曲線。

CD3xCD19 BiTE 抗體誘導細胞毒性和靶細胞聚集。Ramos NucLight 綠色細胞與 PBMC 共同接種,使用 BiTE 抗體 (anti-hCD3xCD19) 或對照抗體 (anti-hCD3xβGAL) 激活。在 (A) 對照抗體或 (B) BiTE 抗體的存在下 72 小時的代表性圖像。跟蹤靶細胞數量 (C) 和聚集 (E) 的 Incucyte? 時間進程數據(每 3 小時采集一次圖像)。采用包括亮度和大小的綠色累積強度度量 (GCU × μm2) 的折射率變化來定量靶細胞。與對照抗體相比,BiTE 抗體存在時靶細胞殺傷 (D) 和聚集 (F) 的 72 小時濃度響應曲線。

活化的 PBMC 對腫瘤球增殖的影響。將穩定表達核限制性 RFP 的 A549 腫瘤細胞接種在一個圓底 ULA 96 孔板中,培養 3 天,待其形成腫瘤球。腫瘤球形成后,在含或不含 Anti-CD3 和 IL-2 抗體混合物的條件下,與新分離的 PBMC 進行共培養。Incucyte? HD 相位圖和熒光圖像顯示了 PBMC 在不含抗-CD3 和 IL-2 抗體(未活化,上圖)和含抗-CD3 和 IL-2 抗體(已活化,下圖)的情況下對腫瘤球增殖的影響對比。注意到,活化的 PBMC 存在時,腫瘤球的熒光強度明顯減弱。時程圖顯示了腫瘤球的細胞毒性(根據熒光強度隨時間的損失來定量)。數據收集時間為 7 天,每間隔 6 小時采集一次圖像。每個數據點代表平均值 ± SEM,n = 3 孔。

白細胞滲出的可視化處理。將 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 細胞接種到單層 HUVEC 細胞(由纖連蛋白培養)上,使用 Incucyte? 系統每分鐘采集一次圖像。黃色和橙色箭頭表示白細胞在 HUVEC 細胞之間移動,最終沿著 ClearView 插入物的孔隙(藍色圓圈)移動。

原代 T 細胞向 CXCL12 外滲。將 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 細胞接種到纖連蛋白培養的 HUVEC 單層膜上。然后,將含 T 細胞的插入物(HUVEC 單層共培養物)在指示濃度下暴露于 CXCL12 梯度中。使用 Incucyte? ZOOM 每 30 分鐘采集一次圖像,并進行相位分析。在 t = 6 小時進行藥理學反應分析。每個數據點代表平均值 ± SEM,n = 4

參考文獻

集群
Zumwalde et al, 2013 J Immunol. October 1; 191(7): 3681–3693. doi:10.4049/jimmunol.1201954.

免疫細胞殺傷
McCormack et al, 2013 Cancer Immunol Immunother. Apr; 62(4): 773–785. doi:10.1007/s00262-012-1384-4

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